分光光度计的原理及应用

分光光度计就是利用分光光度法对物质进行定量定性分析的仪器。该仪器是食品厂、饮用水厂办理QS、HACCP认证的*检验设备。 　　分光光度计已经成为现代分子生物实验室常规仪器。常用于核酸，蛋白定量以及细菌生长浓度的定量。仪器分光光度计主要由光源、单色器、样品室、检测器、信号处理器和显示与存储系统组成。 　　分光光度计计采用一个可以产生多个波长的光源，通过系列分光装置，从而产生特定波长的光源，光源透过测试的样品后，部分光源被吸收，计算样品的吸光值，从而转化成样品的浓度。样品的吸光值与样品的浓度成正比。 核酸的定量 　　核酸的定量是分光光度计使用频率zui高的功能。可以定量溶于缓冲液的寡核苷酸，单链、双链DNA，以及RNA。核酸的zui高吸收峰的吸收波长260 nm。每种核酸的分子构成不一，因此其换算系数不同。定量不同类型的核酸，事先要选择对应的系数。如：1OD 的吸光值分别相当于50μg/ml的dsDNA，37μg/ml的ssDNA，40μg/ml的RNA，30μg/ml的Olig。测试后的吸光值经过上述系数的换算，从而得出相应的样品浓度。测试前，选择正确的程序，输入原液和稀释液的体积，尔后测试空白液和样品液。然而，实验并非一帆风顺。读数不稳定可能是实验者zui头痛的问题。灵敏度越高的仪器，表现出的吸光值漂移越大。 事实上，分光光度计的设计原理和工作原理，允许吸光值在一定范围内变化，即分光光度计有一定的准确度和度。如Eppendorf Biophotometer的准确度≤1.0%（1A）。这样多次测试的结果在均值1.0%左右之间变动，都是正常的。另外，还需考虑核酸本身物化性质和溶解核酸的缓冲液的pH值，离子浓度等：在测试时，离子浓度太高，也会导致读数漂移，因此建议使用pH值一定、离子浓度较低的缓冲液，如TE，可大大稳定读数。样品的稀释浓度同样是不可忽视的因素：由于样品中不可避免存在一些细小的颗粒，尤其是核酸样品。这些小颗粒的存在干扰测试效果。为了zui大程度减少颗粒对测试结果的影响，要求核酸吸光值至少大于0.1A，吸光值在0.1-1.。在此范围内，颗粒的干扰相对较小，结果稳定。从而意味着样品的浓度不能过低，或者过高（超过光度计的测试范围）。zui后是操作因素，如混合要充分，否则吸光值太低，甚至出现负值；混合液不能存在气泡，空白液无

   分光光度计的特点：
         采用微机控制并进行数据处理。　　□用干涉滤光片作为分光元件，光电管进行光电转换。　　□具有钾、钠浓度直读，曲线拟合，灵敏度漂移，自动校正，自动调满度。火焰能量指示，操作失误显示，打印结果等功能。　　□线性稳定性、重现性好，尤其适合临床应用。

    分光光度计就是利用分光光度法对物质进行定量定性分析的仪器。该仪器是食品厂、饮用水厂办理QS、HACCP认证的*检验设备。
     分光光度计已经成为现代分子生物实验室常规仪器。常用于核酸，蛋白定量以及细菌生长浓度的定量。仪器分光光度计主要由光源、单色器、样品室、检测器、信号处理器和显示与存储系统组成。
      分光光度计计采用一个可以产生多个波长的光源，通过系列分光装置，从而产生特定波长的光源，光源透过测试的样品后，部分光源被吸收，计算样品的吸光值，从而转化成样品的浓度。样品的吸光值与样品的浓度成正比。
核酸的定量
核酸的定量是分光光度计使用频率zui高的功能。可以定量溶于缓冲液的寡核苷酸，单链、双链DNA，以及RNA。核酸的zui高吸收峰的吸收波长260 nm。每种核酸的分子构成不一，因此其换算系数不同。定量不同类型的核酸，事先要选择对应的系数。如：1OD 的吸光值分别相当于50μg/ml的dsDNA，37μg/ml的ssDNA，40μg/ml的RNA，30μg/ml的Olig。测试后的吸光值经过上述系数的换算，从而得出相应的样品浓度。测试前，选择正确的程序，输入原液和稀释液的体积，尔后测试空白液和样品液。然而，实验并非一帆风顺。读数不稳定可能是实验者zui头痛的问题。灵敏度越高的仪器，表现出的吸光值漂移越大。
事实上，分光光度计的设计原理和工作原理，允许吸光值在一定范围内变化，即分光光度计有一定的准确度和度。如Eppendorf Biophotometer的准确度≤1.0%（1A）。这样多次测试的结果在均值1.0%左右之间变动，都是正常的。另外，还需考虑核酸本身物化性质和溶解核酸的缓冲液的pH值，离子浓度等：在测试时，离子浓度太高，也会导致读数漂移，因此建议使用pH值一定、离子浓度较低的缓冲液，如TE，可大大稳定读数。样品的稀释浓度同样是不可忽视的因素：由于样品中不可避免存在一些细小的颗粒，尤其是核酸样品。这些小颗粒的存在干扰测试效果。为了zui大程度减少颗粒对测试结果的影响，要求核酸吸光值至少大于0.1A，吸光值在0.1-1.。在此范围内，颗粒的干扰相对较小，结果稳定。从而意味着样品的浓度不能过低，或者过高（超过光度计的测试范围）。zui后是操作因素，如混合要充分，否则吸光值太低，甚至出现负值；混合液不能存在气泡，空白液无